Estrazione delle sostanze naturali

Estrazione delle sostanze naturali

Come sapete le piante sono ricche di sostanze chimiche che possono essere di nostro interesse, e che non possiamo sintetizzare in laboratorio. In questo caso dobbiamo ricorrere all’estrazione, una tecnica che separa le sostanze chimiche naturali dal campione.

Come esempio estraiamo* le molecole contenute nelle foglie di agnocasto o pepe dei monaci. Essa è una pianta di interesse farmacologico.

agnocasto o pepe dei monaci

Tra le molecole contenute nell’olio di agnocasto ci sono: iridoidi, flavonoidi, alcaloidi, terpeni e steroidi.

Il tipico odore di questa pianta e delle sue bacche è dovuto principalmente all’eucaliptolo.

eucaliptolo

Il nome pepe dei monaci deriva dalla proprietà anafrodisiaca di questa pianta, che veniva usata dai monaci per rispettare il voto di castità.

La maggior concentrazione di sostanze di nostro interesse si trova nelle foglie, una volta raccolte le facciamo essiccare all’ombra girandole di tanto in tanto.

Dopo l’essiccazione riduciamo in polvere le foglie secche con un mortaio o un frullatore, questo faciliterà l’estrazione.

Se volete sapere come funziona un estrattore Soxhlet date un’occhiata alla pagina della curcumina. Questa apparecchiatura è impiegata per la estrazione delle sostanze naturali e permette di usare meno solvente rispetto ad una semplice macerazione (come per la preparazione del tè).

Molecole dell’agnocasto e proprietà

Tra le sostanze estratte ci sono: Aucubina e la Agnuside che hanno una funzione difensiva per la pianta.

agnuside

La casticina e la vitexina che fanno parte dei flavonoidi e sono i pigmenti naturali con proprietà antiossidanti.

vitexina

Il loro colore varia a seconda del pH

e della presenza di metalli come il ferro e l’alluminio in quanto si comportano come molecole complessanti (cioè formano dei composti di coordinazione con essi).

Anche le antocianine sono dei flavonoidi e colorano le piante di rosso, blu e violetto.

L’eucaliptolo e il sabinene donano l’aroma caratteristico all’intera pianta.

Gli scienziati hanno riscontrato nell’olio essenziale di agnocasto proprietà antibatteriche, in particolare nell’agnocasto bianco.

Ancora oggi studiamo le interazioni delle molecole contenute nell’Agnocasto sul sistema endocrino, in particolare sulla produzione di alcuni ormoni ipofisari.

Questo agisce sulle irregolarità del ciclo mestruale e sulla riduzione dei sintomi premestruali.

Ciò nonostante come ogni altra sostanza presenta sempre degli effetti collaterali che vanno monitorati.

Analisi delle sostanze naturali

L’estratto ha un colore bruno intenso con un odore molto forte e caratteristico.

Per separare e identificare tutte le sostanze presenti nel pallone ricorriamo alla cromatografia, le tecniche strumentali più usate sono l’HPLC e la GAS-MASSA

video estrazione sul canale

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*Makers ITIS Forlì non si assumono alcuna responsabilità per danni a cose, persone o animali derivanti dall’utilizzo delle informazioni contenute in questa pagina. Tutto il materiale contenuto in questa pagina ha fini esclusivamente informativi.

Analisi dell’alcol polivinilico

Analisi dell’alcol polivinilico

In questa pagina affrontiamo insieme la seconda parte del lavoro del chimico: l’analisi* dei prodotti sintetizzati. In particolare affrontiamo l’analisi dell’alcol polivinilico sintetizzato in precedenza QUI.

Panoramica

Il PVA fu preparato la prima volta da Hermann e Haehnel nel 1924 idrolizzando il PVAc. Si idrolizzano i gruppi acetato in etanolo in presenza di NaOH.

Le caratteristiche fisiche e chimiche dipendono dal grado di idrolisi e di polimerizzazione. PVA si divide in due gruppi: parzialmente e totalmente idrolizzato.

Il PVA è una polvere bianca o giallo tenue inodore e insapore, solubile in acqua ma non nei solventi organici.

PVA è un polimero termoplastico innocuo e atossico. L’alcol polivinilico è biodegradabile tramite idrolisi, ciò è facilitato dai gruppi idrossilici. Le condizioni per la degradazione avvengono in presenza di ossigeno, in ambienti acquosi e nel sottosuolo.

Proprietà fisiche

Tensione superficiale

Si misura la tensione superficiale di soluzioni acquose di PVA a diverse concentrazioni tramite il tensiometro casalingo.

L’alcol polivinilico mostra una temperatura di transizione vetrosa Tg 85°C ed una temperatura di fusione Tm 230°C.

I dati sono ricavati dal profilo di calorimetria differenziale a scansione DSC

Perdita per essicamento (LOD)

Consiste nella differenza di peso del campione prima e dopo un trattamento termico (riscaldamento in forno) fino a peso costante. La differenza di peso indica l’umidità trattenuta naturalmente dal campione.

Si pesa il campione “asciutto” a temperatura ambiente, si registra il valore (m1). Poniamo in stufa il campione ad una temperatura inferiore a quella di fusione (almeno 20°C in meno).
Si fa raffreddare il campione in essiccatore e si registra il peso, si ripete il ciclo termico fino ad ottenere un valore di peso costante (m2).

LOD = [ (m1 – m2) x 100 ] / m1

Proprietà chimiche

Numero di saponificazione

Uno dei parametri misurabili è il numero di saponificazione, esprime la quantità di base necessaria per saponificare un grammo di campione.

Poniamo 1.0 g di campione in un pallone da 250 mL, aggiungiamo 25 mL di NaOH 0.5 M in etanolo, 25 mL di acqua e qualche pallina di vetro (per controllare l’ebollizione). Attacchiamo un condensatore e mettiamo a riflusso per 30 minuti.
Lasciamo raffreddare a temperatura ambiente ed aggiungiamo qualche goccia di fenolftaleina, titoliamo immediatamente con HCl 0.5 M; segnamo il volume (V1).
Ripetiamo la prova con il bianco (non mettiamo il campione) nelle stesse condizioni; segnamo il volume (V2).

Calcoliamo il numero di saponificazione, S:

S = 40 x (V2 – V1) x (M / W)
dove
40 è la massa molare di NaOH
M è la molarità di HCl
W è la massa del campione in (g)

Grado di idrolisi

Un altro parametro calcolabile è il grado di idrolisi. Convertiamo matematicamente il numero di saponificazione S determinato in precedenza nel seguente modo:

Sdb = (S x 100)/(100 – LOD)
dove
LOD è la perdita per essicamento
S è il numero di saponificazione

Il grado di idrolisi, GI:
GI = 100 – [(7.84 X Sdb )/(100 – (0.075 X Sdb))]

Spettro vibrazionale infrarosso FTIR

Eseguiamo uno spettro vibrazionale infrarosso del campione solido. Mettiamo in un mortaio 1mg di PVA e 300 mg di KBr ed omogeneizziamo tutto. Poniamo la polvere in una pressa pastigliatrice ed infiliamo la pastiglia nello spettrometro IR.

I picchi indicati dallo spettro vibrazionale confermano la presenza di gruppi alcolici OH e di alcuni gruppi residui di C=O. Con l’aumento del grado di idrolisi il picco C=O a 1700 cm-1 diminuisce di intensità.

Con l’analisi dell’alcol polivinilico speriamo di trasmettervi una parte importante quanto quella sintetica di sui si occupa un chimico, la caratterizzazione delle nuove sostanze sintetizzate è una sfida complessa quanto la sintesi…se non più difficile.

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Spettroscopia UV-vis

Spettroscopia UV-vis

La spettroscopia UV-vis è una tecnica molto utilizzata in chimica analitica e sfrutta l’interazione fra la luce e la materia. A differenza della spettroscopia IR in questa tecnica si eccitano i livelli elettronici della molecola.

Questa spettroscopia è usata in laboratorio per analisi quantitative, misura la concentrazione di molecole che assorbono nello spettro UV (100-400 nm) e visibile (400-700 nm).

La legge più importante per la quantificazione dell’analita con spettroscopia UV-vis è la legge di Lambert-Beer.

Questa legge afferma che:
La quantità di luce monocromatica assorbita (A) da una soluzione è funzione della concentrazione (c) della sostanza assorbente e della lunghezza del cammino ottico (b).

A = ε b c

legge di lambert-beer

ε è il coefficiente di assorbività molare tipico per ogni sostanza.

Per svolgere le analisi sui campioni si usa lo spettrofotometro UV-vis, uno strumento che permette di misurare l’intensità luminosa assorbita dalle sostanze.

Affrontiamo la struttura dello spettrofotometro in questa pagina, dove trattiamo in maniera più approfondita tutte le sue parti e la costruzione di un colorimetro con Arduino.

Le analisi quantitative più comuni sfruttano il metodo di analisi degli standard esterni. Il chimico prepara* una serie di soluzioni a concentrazioni note contenenti l’analita di interesse. L’assorbanza di queste soluzioni è misurata e si costruisce una retta di calibrazione, cioè una retta che riporta le concentrazioni sull’asse delle ascisse (x) e i valori di assorbanza sull’asse delle ordinate (y).

Con la regressione lineare si trova la retta che approssima meglio tutti i punti sperimentali. Una volta misurata anche l’assorbanza del campione a concentrazione incognita si usa l’equazione della retta di regressione per calcolare la concentrazione. Questo metodo funziona bene solo se la concentrazione del campione incognito è compresa nel range delle soluzioni standard.

Esistono molte altre tecniche di analisi e metodi analitici più complessi che sfruttano la spettroscopia UV-visibile.

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Spettroscopia infrarossa

Spettroscopia infrarossa

La spettroscopia infrarossa è una tecnica di analisi che si basa sull’interazione tra la luce e la materia. Questa tecnica sfrutta una regione dello spettro elettromagnetico compresa tra 2,5 µm e 25 µm degli infrarossi.
La spettroscopia studia l’assorbimento di energia radiativa da parte delle molecole che raggiungono uno stato eccitato.

Modi vibrazionali


L’eccitazione (di spin, elettronica, vibrazionale, ecc…) dipende dalla quantità di energia quindi anche dal tipo di radiazione. In particolare l’IR è associata ad una eccitazione vibro-rotazionale delle molecole. I due principali moti vibrazionali sono lo stretching e il bending.
Lo stretching è la variazione della lunghezza dei legami tra gli atomi mentre il bending è la variazione dell’angolo di legame tra gli atomi. L’energia dei moti di stretching è più alta di quella dei bending.

L’assorbimento di energia molecolare è quantizzato perciò ci aspetteremo uno spettro con delle righe tuttavia la radiazione infrarossa eccita sia livelli vibrazionali che rotazionali (a più bassa energia) perciò lo spettro presenta delle bande.

Interazione luce-materia e variazione del momento di dipolo

Il campo elettrico alternante prodotto dalla variazione della carica elettrica molecolare, accoppia la vibrazione della molecola al campo elettrico oscillante della radiazione.
Sono visibili in uno spettro IR solo vibrazioni che cambiano il momento di dipolo netto della molecola.

In spettroscopia IR si usa il numero d’onda piuttosto che la frequenza perciò bisogna saper convertire le diverse unità di misura della frequenza e dell’energia.

E energia [J]
h cost. Planch [J/m]
c velocità luce [m/s]
T periodo [s]
λ lunghezza d’onda [m]
v frequenza [Hz]
˜ν numero d’onda [cm-1 ]

Energia dei livelli vibrazionali

I livelli energetici si calcolano in modo approssimato secondo il modello dell’oscillatore armonico e della forza di Hooke.

Approssimiamo gli atomi a delle sfere dotate di massa e il legame chimico come una molla perciò la vibrazione legata alla molecola è

v è la frequenza fondamentale di risonanza (numero d’onda)
µ è la massa ridotta che dipende dalla massa degli atomi
k è la costante di forza della molla che dipende dal tipo di legame
c è la velocità della luce

Spettroscopia Raman

La spettroscopia infrarossa non percepisce i moti vibrazionali simmetrici perciò si deve ricorrere ad un’altra tipologia di analisi spettroscopica. Questa tecnica è la spettroscopia Raman, sfrutta la luce diffusa da un campione sottoposto ad un fascio laser incidente.

Strumento*

Lo spettrofotometro ad infrarossi è costituito da vari componenti che dividiamo in blocchi concettuali e rappresentiamo in una filiera strumentale.
Esistono due tipi di spettrofotometri: dispersione e trasformata di Fourier.
Oggigiorno il modello più utilizzato è a trasformata di Fourier (FTIR) in quanto riesce a garantire maggiori prestazioni: risoluzione costante lungo tutto lo spettro, tempi di analisi brevi e alto rapporto segnale/rumore.

La filiera strumentale di uno FTIR è costituita da:

  • sorgente
  • interferometro
  • cella porta campione
  • rivelatore
  • computer

Sorgente

Le sorgenti per spettrofotometri IR sono molteplici e si scelgono valutando lo spettro di emissione, la robustezza operativa e il costo. Le principali sono lampade con filamenti di: carburo di silicio, ossidi fusi, nichel-cromo e tungsteno.

Interferometro

L’interferometro di Michelson è la configurazione di interferometro più utilizzata negli FTIR. Questo apparecchio è costituito da uno specchio semitrasparente che divide un fascio luminoso proveniente dalla sorgente in due fasci secondari di uguale intensità. I due fasci secondari vengono riflessi da due specchi e fatti collimare su uno stesso punto. Uno dei due specchi è mobile e permette di variare la lunghezza del cammino ottico di uno dei due raggi secondari.
L’interferometro permette di convertire lo spettro di emissione della sorgente in un interferogramma perciò non c’è più necessità di dividere il fascio luminoso nelle sue componenti monocromatiche come avviene in uno spettrofotometro a dispersione.
Per monitorare lo spostamento dello specchio mobile si contano le frange di interferenza di un fascio laser He-Ne fatto entrare nell’interferometro parallelamente al fascio della sorgente.

Cella porta campione

Esistono diversi modi per introdurre un campione negli spettrofotometri IR che dipendono dallo stato fisico del campione, dalla composizione chimica e dal costo.

Campione solido

pastiglia:  si mescolano con un mostaio di agata 1mg di campione e 300mg di KBr e si forma una pastiglia con una pasticcatrice a 10Ton per 2 min.
ATR: è una tecnica che sfrutta un particolare inserto che permette di premere il campione solido contro un cristallo tramite un morsetto. Il raggio IR rimbalza ripetutamente tra il cristallo e la superficie del campione per poi rientrare nello strumento.
nujol: si mescola il campione solido con una paraffina ad alto peso molecolare(nujol) e si pone il miscuglio tra due pastiglie di NaCl o AgBr puri (come un sandwich).

Campione liquido

pastiglie: si pone qualche goccia di campione tra due pastiglie di NaCl  o AgBr puri (come un sandwich)
ATR: si pone qualche goccia di campione sul cristallo e si chiude senza serrare il morsetto

Campione gassoso

cella: si spurga una cella per campioni gassosi con un flusso di gas inerte e tramite un sistema pneumatico si introduce il campione gassoso avvinando la cella.

Rivelatore

Esistono vari tipi di rivelatori per spettrofotometri IR, i principali sono: bolometri, termocoppie, cristalli piroelettrici, cella di Golay e semiconduttori. Ognuno di essi viene valutato secondo i tempi di risposta, limite di rivelabilità, costo e molto altro.

Computer

Il ruolo del computer oltre che monitorare, gestire l’ottica e collezionare i segnali dal rivelatore è quello di convertire l’interferogramma in uno spettro attraverso la trasformata di Fourier.
Esistono algoritmi per svolgere questa operazione complessa che hanno permesso in passato di ottenere un risultato in tempi più rapidi come l’algoritmo di Cooley e Tukey.
Il computer restituisce lo spettro sulle periferiche di uscita (monitor e stampante) e può contenere un database con una serie di molecole per eseguire il riconoscimento automatico di molecole comuni, ciò non toglie però che l’operatore deve saper eseguire l’analisi di uno spettro di una sostanza incognita che potrebbe non essere contenuta all’interno della memoria del computer.

Spettri

Gli spettri sono grafici che mostrano la % trasmittanza del campione in funzione della frequenza della radiazione espressa in cm-1
Solitamente gli spettri IR hanno un intervallo di frequenza sull’asse X compreso tra 4000 e 400 cm-1
Per ogni tipologia di gruppo funzionale presente nelle molecole esiste una serie di bande caratteristiche utili ad identificare il campione incognito.

La regione dello spettro compresa tra 400 e 1500 cm-1 è detta delle impronte digitali ed è caratteristica dello scheletro carbonioso di ogni singola molecola. Non esistono molecole diverse tra loro che possiedono la stessa regione delle impronte digitali.

Di seguito sono riportate le principali famiglie di composti organici con le loro bande caratteristiche.

alcani
alcheni
alchini
nitrili
alcoli
acidi carbossilici
aldeidi
chetoni
esteri
eteri
ammine
ammidi
composti aromatici

Molecole complesse saranno costituite dall’insieme delle varie bande tipiche di ogni gruppo funzionale precedentemente mostrate.

Gli intervalli di frequenza delle bande dei vari gruppi funzionali possono variare perché dipendono da molti fattori come la concentrazione del campione, la presenza di isotopi, ecc…
La spettroscopia IR non è sufficiente da sola a identificare la struttura di una molecola incognita perciò deve essere accompagnata da altre tecniche analitiche (HNMR,CNMR e MS), tuttavia è la più veloce per identificare i vari gruppi funzionali di un composto.

spettri scaricati da:
SDBSWeb : https://sdbs.db.aist.go.jp (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,25/12/2020)

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Il test del Biureto

Il test del Biureto

Il test del biureto serve per la determinazione delle proteine. Ma a cosa ci serve identificare le proteine? Lo studio delle proteine mutate nell’organismo può portarci ad una diagnosi precoce delle patologie tumorali.

Le proteine sono macromolecole formate da amminoacidi, sono di importanza cruciale per il nostro corpo in quanto svolgono molte funzioni:

    • strutturale
    • catalitico / enzimatico
    • di neurotrasmettitori
    • per la risposta immunitaria

Cos’è il biureto?

Il biureto è un composto chimico risultante dalla condensazione di due molecole di urea. È un solido bianco, solubile in acqua calda, che si ottiene riscaldando l’urea a 180 °C. Durante la sintesi si libera ammoniaca sotto forma di gas.

Sintesi del biureto*

Si pone una punta di spatola di urea in una provetta e si riscalda su un bunsen. Per controllare la conversione della reazione si pone una cartina tornasole inumidita con acqua sull’imboccatura della provetta che assumerà una colorazione blu a contatto con l’ammoniaca prodotta.

Reattivo per il test

Il reattivo per il test del biureto è composto da una soluzione basica di ioni rame Cu2+. Per stabilizzare il reattivo impedendo la precipitazione di composti di rame si può aggiungere del tartato di sodio. In presenza di peptidi si osserva una colorazione viola dovuta alla formazione di un complesso di rame.

Eseguiamo il test del biureto

Si aggiunge 1mL di NaOH 0,2M e qualche goccia di CuSO4 1% alla provetta contenente il campione da analizzare, se la soluzione si colorerà di viola il test sarà positivo. Sia per il collagene (foglio di colla di pesce) che per il biureto il test sarà positivo indicando la presenza di gruppi peptidici mentre in una provetta contenente zucchero il test sarà negativo.

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Cromatografia

Cromatografia

Nei laboratori di chimica analitica si cerca di separare i componenti da miscele complesse, questo per facilitare le analisi. Le tecniche di separazione sono molte, una di queste è la cromatografia.

La cromatografia fu inventata da botanico Russo Tsvet all’inizio del ‘900, con questa tecnica lo scienziato riuscì a separare la clorofilla da un estratto vegetale di foglie. Tsvet fece macerare la materia vegetale in un solvente a base di etere di petrolio e percolò il solvente attraverso una colonna riempita di polvere di gesso anidra. Con il passare del tempo questa nuova tecnica separativa fu introdotta in tutti i laboratori chimici ed oggi sono state sviluppate numerose tecniche cromatografiche differenti che permettono di separare le sostanze in base a svariate proprietà chimico-fisiche.

La cromatografia si basa sulla diversa affinità di un analita per una fase stazionaria ed una fase mobile. Se si prende una miscela di analiti trasportati da una fase mobile attraverso una fase stazionaria i componenti di questa miscela percorreranno la fase stazionaria in tempi diversi, questi tempi vengo denominati tempi di ritenzione. Maggiore sarà l’affinità di un componente per la fase stazionaria e maggiore sarà il suo tempo di ritenzione. Esistono vari tipi di cromatografia e queste possono essere classificate in base ai processi di separazione o allo stato fisico della fase mobile impiegata.

I principali processi di separazione sono quattro:

    • adsorbimento
    • ripartizione
    • scambio ionico
    • esclusione dimensionale

Lo stato fisico della fase mobile può essere liquido o gassoso. Inoltre possiamo fare un’ulteriore discriminazione In base allo stato fisico della fase stazionaria, essa potrà essere liquida o solida.

Cromatografia

Un esempio di cromatografia liquido-liquido è la cromatografia su carta.

Come mai la cromatografia su carta (che sfrutta un supporto solido) dovrebbe avere una frase stazionaria liquida?

Perché la carta contiene una percentuale di umidità che compone la vera e propria fase stazionaria mentre la cellulosa funge da impalcatura.

Per saperne di più e vedere qualche esperimento* sulla cromatografia guardate il video

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